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慧穎Elisa試劑盒一般操作流程

發布時間:2015-06-24瀏覽:1344次

已稀釋好的ABCTMB顯色液在加入酶標板孔前都應預先在37℃中平衡至少30分鐘。試劑或樣品稀釋時,切不可忘記混勻。每次檢測都應該做標準曲線。用戶須估計樣品待測因子的含量,決定適當的稀釋倍數。

1.    確定本次檢測所需的已包被抗體的酶標板孔數目,并增加1孔作為TMB空白顯色孔。總數=樣品數+9;做雙份檢測時×2。其余重包裝好放如冰箱中。

2.    1000pg/ml 500pg/ml250pg/ml125pg/ml62.5pg/ml31.3pg/ml15.6pg/ml的標準品各0.1ml依次加入一排7孔中,1孔只加樣品稀釋液的作為零孔。對于人血清、血漿、體液、組織勻漿或細胞培養上清,直接加已用樣品稀釋液稀釋的樣品100μι。

3. 酶標板加上蓋,37℃反應90分鐘。

4. 反應后用自動洗板機吸去酶標板內的液體;或甩去酶標板內液體,再對著吸水紙拍幾下。不洗。

5. 將準備好的生物素抗人IL-2抗體工作液按每孔0.1ml依次加入。(TMB空白顯色孔除外)。37℃反應60分鐘。

6. 0.01M TBS0.01M PBS洗滌3次,每次浸泡1分鐘左右。

7. 將準備好的ABC工作液按每孔0.1ml依次加入(TMB空白顯色孔除外)。37℃反應30分鐘。

8. 0.01M TBS0.01M PBS洗滌5次,每次浸泡1-2分鐘左右。

9. 按每孔90μι依次加入已在37℃平衡30分鐘的TMB顯色液,37℃避光反應8-12分鐘(注意:顯色時間供參考,因用戶實驗室條件差異,*顯色時間會有所不同。此時肉眼可見標準品的前3-4孔有明顯的梯度藍色,后3-4孔差別不明顯)。

10. 按每孔0.1ml依次加入TMB終止液,此時藍色立轉黃色。

11. 用酶標儀在450nm測定O.D.值。顯色的程度通過ELISA酶標檢測儀測定光密度(ODoptical density)記錄。通過細胞因子的標準蛋白做已知濃度系列稀釋,測出OD值后繪制出標準曲線,根據標準曲線可推算出標本中細胞因子的含量,一般使用計算機軟件可以很快得到結果

有兩種設定空白對照的方案:

1)將TMB空白顯色孔設為對照。所有的標準品和樣品的吸光值減去零孔的吸光值后,在坐標紙上畫出曲線,以吸光值作為縱坐標,以濃度作為橫坐標。

2)將零孔設為對照。得到的數據可以直接在坐標紙上畫出曲線。

12. 根據樣品的吸光值在坐標上找出對應的濃度。應記住由于樣品稀釋了N倍,其實際濃度應該×N

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