成人观看视频-成人观看网站a-成人国产mv免费视频-成人国产第一区在线观看-成人国产激情福利久久精品-成人国产精品

服務熱線:
15821734033
產(chǎn)品目錄/ PRODUCT MENU
技術(shù)支持

您現(xiàn)在的位置:首頁  >  技術(shù)文章  >  細胞凋亡檢測方法

細胞凋亡檢測方法

發(fā)布時間:2015-01-06瀏覽:1682次

細胞凋亡檢測方法

   細胞凋亡與壞死是兩種*不同的細胞凋亡形式,根據(jù)死亡細胞在形態(tài)學、生物化學和分子生物學上的差別,可以將二者區(qū)別開來。細胞凋亡的檢測方法有很多,下面介紹幾種常用的測定方法。

一、細胞凋亡的形態(tài)學檢測

  根據(jù)凋亡細胞固有的形態(tài)特征,人們已經(jīng)設(shè)計了許多不同的細胞凋亡形態(tài)學檢測方法。
   1 光學顯微鏡和倒置顯微鏡
   (1) 未染色細胞:凋亡細胞的體積變小、變形,細胞膜完整但出現(xiàn)發(fā)泡現(xiàn)象,細胞凋亡晚期可見凋亡小體。
貼壁細胞出現(xiàn)皺縮、變圓、脫落。
   (2) 染色細胞:常用姬姆薩染色、瑞氏染色等。凋亡細胞的染色質(zhì)濃縮、邊緣化,核膜裂解、染色質(zhì)分割
成塊狀和凋亡小體等典型的凋亡形態(tài)。
   2 熒光顯微鏡和共聚焦激光掃描顯微鏡
   一般以細胞核染色質(zhì)的形態(tài)學改變?yōu)橹笜藖碓u判細胞凋亡的進展情況。
   常用的DNA特異性染料有:HO 33342 (Hoechst 33342),HO 33258 (Hoechst 33258), DAPI。三種染料與 DNA的結(jié)合是非嵌入式的,主要結(jié)合在DNA的A-T堿基區(qū)。紫外光激發(fā)時發(fā)射明亮的藍色熒光。
   Hoechst是與DNA特異結(jié)合的活性染料,儲存液用蒸餾水配成1mg/ml的濃度,使用時用PBS稀釋成終濃度為2~5mg/ml。
   DAPI為半通透性,用于常規(guī)固定細胞的染色。儲存液用蒸餾水配成1mg/ml的濃度,使用終濃度一般為0.5 ~1mg/ml。
   結(jié)果評判:細胞凋亡過程中細胞核染色質(zhì)的形態(tài)學改變分為三期:Ⅰ期的細胞核呈波紋狀(rippled)或呈折縫樣(creased),部分染色質(zhì)出現(xiàn)濃縮狀態(tài);Ⅱa期細胞核的染色質(zhì)高度凝聚、邊緣化;Ⅱb期的細胞核裂解為碎塊,產(chǎn)生凋亡小體(圖1)。

3 透射電子顯微鏡觀察
   結(jié)果評判:凋亡細胞體積變小,細胞質(zhì)濃縮。凋亡Ⅰ期(pro-apoptosis nuclei)的細胞核內(nèi)染色質(zhì)高度盤繞,出現(xiàn)許多稱為氣穴現(xiàn)象(cavitations)的空泡結(jié)構(gòu)(圖2);Ⅱa期細胞核的染色質(zhì)高度凝聚、邊緣化;細胞凋亡的晚期,細胞核裂解為碎塊,產(chǎn)生凋亡小體。

二、磷脂酰絲氨酸外翻分析(Annexin V法)

  磷脂酰絲氨酸(Phosphatidylserine, PS)正常位于細胞膜的內(nèi)側(cè),但在細胞凋亡的早期,PS可從細胞膜的內(nèi)側(cè)翻轉(zhuǎn)到細胞膜的表面,暴露在細胞外環(huán)境中(圖3)。Annexin-V是一種分子量為35~36KD的Ca2+依賴性磷脂結(jié)合蛋白,能與PS高親和力特異性結(jié)合。將Annexin-V進行熒光素(FITC、PE)或biotin標記,以標記了的Annexin-V作為熒光探針,利用流式細胞儀或熒光顯微鏡可檢測細胞凋亡的發(fā)生。
   碘化丙啶(propidine iodide, PI)是一種核酸染料,它不能透過完整的細胞膜,但在凋亡中晚期的細胞和死細胞,PI能夠透過細胞膜而使細胞核紅染。因此將Annexin-V與PI匹配使用,就可以將凋亡早晚期的細胞以及死細胞區(qū)分開來。

方法
   1 懸浮細胞的染色:將正常培養(yǎng)和誘導凋亡的懸浮細胞(0.5~1×106)用PBS洗2次,加入100ul Binding Buffer和FITC標記的Annexin-V(20ug/ml)10ul,室溫避光30min,再加入PI(50ug/ml)5ul,避光反應5min后,加入400ul Binding Buffer,立即用FACScan進行流式細胞術(shù)定量檢測(一般不超過1h), 同時以不加AnnexinV-FITC及PI的一管作為陰性對照。
   2 貼壁培養(yǎng)的細胞染色:先用0.25%的胰酶消化,洗滌、染色和分析同懸浮細胞。
   3 爬片細胞染色:同上,zui后用熒光顯微鏡和共聚焦激光掃描顯微鏡進行觀察。

 注意事項
   1. 整個操作動作要盡量輕柔,勿用力吹打細胞。
   2. 操作時注意避光,反應完畢后盡快在一小時內(nèi)檢測。

三、線粒體膜勢能的檢測

  線粒體在細胞凋亡的過程中起著樞紐作用,多種細胞凋亡刺激因子均可誘導不同的細胞發(fā)生凋亡,而線粒體跨膜電位的下降,被認為是細胞凋亡級聯(lián)反應過程中zui早發(fā)生的事件,它發(fā)生在細胞核凋亡特征(染色質(zhì)濃縮、DNA斷裂)出現(xiàn)之前,一旦線粒體DYmt崩潰,則細胞凋亡不可逆轉(zhuǎn)。
   線粒體跨膜電位的存在,使一些親脂性陽離子熒光染料如Rhodamine 123、3,3-Dihexyloxacarbocyanine iodide[DiOC6(3)]、Tetrechloro-tetraethylbenzimidazol carbocyanine iodide[JC-1]、Tetramethyl rhodamine methyl ester(TMRM)等可結(jié)合到線粒體基質(zhì),其熒光的增強或減弱說明線粒體內(nèi)膜電負性的增高或降低。
   方法:將正常培養(yǎng)的細胞和誘導凋亡的細胞加入使用終濃度為Rhodamine 123(1mM)或終濃度為DiOC6(25nM),JC-1(1mM),TMRM(100nM),37°C平衡30min,流式細胞計檢測細胞的熒光強度。
   注意事項
   1. 始終保持平衡染液中pH值的一致性,因為pH值的變化將影響膜電位。
   2. 與染料達到平衡的細胞懸液中如果含有蛋白,他們將與部分染料結(jié)合,降低染料的濃度,引起假去極化。

四、DNA檢測

  細胞凋亡時主要的生化特征是其染色質(zhì)發(fā)生濃縮, 染色質(zhì)DNA在核小體單位之間的連接處斷裂, 形成50~300kbp長的DNA大片段, 或180~200bp整數(shù)倍的寡核苷酸片段, 在凝膠電泳上表現(xiàn)為梯形電泳圖譜(DNA ladder)。細胞經(jīng)處理后,采用常規(guī)方法分離提純DNA,進行瓊脂糖凝膠和溴化乙啶染色,在凋亡細胞群中可觀察到典型的DNA ladder。如果細胞量很少,還可在分離提純DNA后,用32P-ATP和脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶(TdT)使DNA標記,然后進行電泳和放射自顯影,觀察凋亡細胞中DNA ladder的形成。
   1. 大分子染色體DNA測定
細胞凋亡的早期,染色體斷裂成為50~300kbp長的DNA大片段。所有超過一定分子量大小的雙鏈DNA分子在瓊脂糖凝膠中的遷移速度相同。線性DNA的雙螺旋半徑超過凝膠半徑時,即達到分辨力的極限。此時凝膠不再按分子量的大小來篩分DNA,DNA像通過彎管一樣,以其一端指向電場一極而通過凝膠,這種遷移模式稱之為"爬行"。因此,細胞凋亡早期產(chǎn)生的50~300kbp長的DNA大片段不能用普通的瓊脂糖凝膠電泳來分離。通常采用脈沖電泳技術(shù)可圓滿地解決這一問題。這個方法是在凝膠上外加正交的交變脈沖電場。每當電場方向改變后,大的DNA分子便滯流在爬行管中,直至新的電場軸向重新定向后,才能繼續(xù)向前移動。DNA分子量越大,這種重排所需要的時間就越長。當DNA分子變換方向的時間小于電脈沖周期時,DNA就可以按其分子量大小分開。
   參考文獻 Brown,D.G., Sun, X.M., and Cohen, G.M.(1993) Dexamethasone-induced apoptosis involves cleavage of DNA to large fragments prior to internucleosomal fragmentation. J. Biol.Chem. 268, 3037-3039
   2. DNA Ladder 測定
   方法:收獲細胞(1X107)沉淀?細胞裂解液?13000rpm′5min, 收集上清?1%SDS和RnaseA(5mg/ml)56°C,
2h?蛋白酶K(2.5mg/ml)37°C,2h?1/10體積3M醋酸鈉和2.5倍體積的冷無水乙醇沉淀DNA,4°C一夜?14000rpm′15min?zui后將沉淀溶解在TE buffer中,加DNA Loading Buffer?1.2%瓊脂糖凝膠電泳,EB染色并照相。

3. 凋亡細胞DNA含量的流式細胞計分析
   方法:收集細胞,70%冷乙醇(in PBS)4°C固定置夜,PBS洗滌,1000rpm′10min RNase A(0.5mg/ml)37°C消化30min PI(50mg/ml)染色,室溫避光15min,F(xiàn)ACScan分析DNA亞二倍體的形成及細胞周期的變化。

4. ApoAlertTM LM-PCR Ladder Assay (CLONTECH)
優(yōu)點:敏感度高,適合于檢測少量樣本,小部分凋亡細胞。如臨床活組織檢測。

五 TUNEL法

  細胞凋亡中, 染色體DNA雙鏈斷裂或單鏈斷裂而產(chǎn)生大量的粘性3'-OH末端,可在脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶(TdT)的作用下,將脫氧核糖核苷酸和熒光素、過氧化物酶、堿性磷酸酶或生物素形成的衍生物標記到DNA的3'-末端,從而可進行凋亡細胞的檢測,這類方法稱為脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導的缺口末端標記法(terminal -deoxynucleotidyl transferase mediated nick end labeling, TUNEL)。由于正常的或正在增殖的細胞幾乎沒有DNA的斷裂,因而沒有3'-OH形成,很少能夠被染色。TUNEL實際上是分子生物學與形態(tài)學相結(jié)合的研究方法,對完整的單個凋亡細胞核或凋亡小體進行原位染色,能準確地反應細胞凋亡典型的生物化學和形態(tài)特征,可用于石蠟包埋組織切片、冰凍組織切片、培養(yǎng)的細胞和從組織中分離的細胞的細胞形態(tài)測定,并可檢測出極少量的凋亡細胞,因而在細胞凋亡的研究中被廣泛采用。
六、Caspase-3活性的檢測

 Caspase家族在介導細胞凋亡的過程中起著非常重要的作用,其中caspase-3為關(guān)鍵的執(zhí)行分子,它在凋亡信號傳導的許多途徑中發(fā)揮功能。Caspase-3正常以酶原(32KD)的形式存在于胞漿中,在凋亡的早期階段,它被激活,活化的Caspase-3由兩個大亞基(17KD)和兩個小亞基(12KD)組成,裂解相應的胞漿胞核底物,zui終導致細胞凋亡。但在細胞凋亡的晚期和死亡細胞,caspase-3的活性明顯下降。
   1 Western blot 分析Procaspase-3的活化,以及活化的Caspase-3及對底物多聚(ADP-核糖)聚合酶[poly(ADP-ribose)polymerase,PARP]等的裂解。
   方法:
   收集細胞→PBS洗滌→抽提細胞裂解液→蛋白定量→SDS-PAGE電泳→硝酸纖維素膜或PVDF膜轉(zhuǎn)移→5%脫脂奶粉封閉,室溫1.5~2h或4°C置夜→Caspase-3多抗或單抗室溫反應1~2h或4°C置夜→TBS-T(含0.05% Tween 20的TBS)洗3次,5~10min/次→HRP-標記的羊抗鼠IgG或AP標記的羊抗鼠IgG室溫反應1~2h→ TBS-T洗3次, 5~10min/次?→ECL顯影或NBT/BCIP顯色。

2 熒光分光光度計分析
   原理:活化的Caspase-3能夠特異切割D1E2V3D4-X底物,水解D4-X肽鍵。根據(jù)這一特點,設(shè)計出熒光物質(zhì)偶聯(lián)的短肽Ac-DEVD-AMC。在共價偶聯(lián)時,AMC不能被激發(fā)熒光,短肽被水解后釋放出AMC,自由的AMC才能被激發(fā)發(fā)射熒光。根據(jù)釋放的AMC熒光強度的大小,可以測定caspase-3的活性,從而反映Caspase-3被活化的程度。
   方法:收獲細胞正常或凋亡細胞,PBS洗滌,制備細胞裂解液加Ac-DEVD-AMC(caspase-3四肽熒光底物)?37°C反應1h,熒光分光光度計(Polarstar)分析熒光強度(激發(fā)光波長380nm,發(fā)射光波長為430-460nm)。

3 流式細胞術(shù)分析
   方法:收獲細胞正常或凋亡細胞?PBS洗滌,加Ac-DEVD-AMC 37°C反應1h UV流式細胞計分析caspase-3陽性細胞數(shù)和平均熒光強度。

七、凋亡相關(guān)蛋白TFAR19蛋白的表達和細胞定位分析

  TFAR19(PDCD5)是由本研究室在上首先報導的一個擁有自己知識產(chǎn)權(quán)的人類新基因,前期的功能研究表明,它是促進細胞凋亡的增強劑。利用熒光素(FITC)標記的TFAR19單克隆抗體為探針,對細胞凋亡過程中TFAR19蛋白的表達水平及定位研究發(fā)現(xiàn),凋亡早期TFAR19表達水平增高并出現(xiàn)快速核轉(zhuǎn)位現(xiàn)象,伴隨著細胞核形態(tài)學的變化,持續(xù)較長時間,在凋亡小體中仍然可見。同時我們發(fā)現(xiàn),凋亡早期TFAR19蛋白的核轉(zhuǎn)位早于磷脂酰絲氨酸(PS)外翻和細胞核DNA的片段化,提示TFAR19蛋白的核轉(zhuǎn)位是細胞凋亡更早期發(fā)生的事件之一。進一步的研究證明,凋亡早期TFAR19的核轉(zhuǎn)位具有普遍意義,不同細胞凋亡早期均出現(xiàn)TFAR19高表達和核轉(zhuǎn)位。這為研究細胞凋亡早期所發(fā)生的事件,提供了一種新的技術(shù)和指標。
   (一)TFAR19蛋白的細胞定位分析
   材料試劑:
FITC標記的單克隆抗體,pH7.4 、0.15Mol/L PBS,3%的多聚甲醛,PBS-T(pH7.4 、0.15Mol/L PBS 含0.2% Tween 20),胎牛血清,熒光細胞洗液:pH7.4 、0.15Mol/L PBS含2%胎牛血清及0.1%NaN3 。FACS管,Tip頭,移液器。
   儀器:低溫水平離心機, 37°C水浴箱,熒光顯微鏡,共聚焦激光掃描顯微鏡,流式細胞計
   方法:
   1 懸浮細胞的染色:
   (1)收獲正常和誘導凋亡的細胞(0.5~1′106),PBS洗2次,1000rpm′10min。
   (2)3%多聚甲醛冰浴10min,PBS洗2次,1000rpm′10min。
   (3)加入PBS-T溶液,37°C孵育15min,PBS洗2次,1000rpm′10min。
   (4)加入200ml胎牛血清,室溫反應30min。
   (5)加入5ml FITC標記的TFAR19單抗(終濃度為1:40),4°C反應30min
   (6)熒光細胞洗液洗2次,1000rpm 10min。
結(jié)果觀察:將細胞沉淀滴片,熒光顯微鏡及共聚焦激光顯微鏡下觀察TFAR19在細胞中的定位。同時用流式細胞計定量檢測TFAR19蛋白的平均熒光強度。

2:貼壁細胞的原位染色
   (1) 貼壁生長的對數(shù)期細胞鋪在24孔或6孔板中(內(nèi)有潔凈蓋玻片),讓其爬片生長,待長到
50%~80%滿時,凋亡誘導劑處理細胞。
   (2) 將不同時間點處理的細胞進行免疫熒光染色,染色步驟同上。
   (3) 將染色的爬片細胞放于一張滴有少量甘油(5ml)的載玻片上,熒光顯微鏡或共聚焦激光掃描顯微鏡觀察TFAR19在細胞中的定位。

3:臨床病理切片的染色、檢測。
   4:原代細胞的培養(yǎng)、檢測。
   5:分析TFAR19蛋白在人體內(nèi)各組織器官的分布及定位
   (二)TFAR19蛋白的表達與臨床疾病
   1. ELISA法檢測正常人和疾病狀態(tài)下,以及疾病的不同時期,血清中TFAR19蛋白水平及其TFAR19自身抗體水平。
   材料和試劑:
   1. 包被Buffer: pH9.6, 0.05Mol/L碳酸鹽Buffer
   2. 洗滌液: pH7.4, 0.15Mol/L PBS 含0.05% Tween 20
   3. 封閉液: 3%BSA(用洗滌液配制)
   4. 酶標抗體的稀釋:用封閉液稀釋
   5. OPD底物Buffer:Na2HPO4.12H2O 1.84g
檸檬酸 0.51g
DDW 100ml
   6. 顯色液(現(xiàn)配現(xiàn)用):底物Buffer 10ml
OPD 2mg
30% H2O2 2ml
   7. 終止液 2Mol/L H2SO48. 重組人TFAR19, HRP標記的羊抗人IgG9. ELISA板, Tip, 移液器,ELISA
Reader(OD490nm),洗板機
   操作步驟
   1. 用包被Buffer稀釋的重組人TFAR19(1mg/ml)包被ELISA板, 100ml/well, 37°C孵育2h或4°C置夜(一般24h以上)。
   2. 洗滌Buffer洗板三次,加入封閉液,200 ml/well , 37°C孵育2h或4°C
置夜。
   3. 洗滌Buffer洗板三次,加入不同稀釋度的病人血清(3個重復孔)100ml/well ,37°C孵育1h。設(shè)包被Buffer、洗滌Buffer 、封閉液為陰性對照。
   4. 洗滌Buffer洗板三次,加入1:2500稀釋的HRP標記的抗人IgG, 100ml/well,37°C孵育1h。
   5. 洗滌Buffer洗板三次,加入顯色液,100 ml/well,避光反應10~15min。
   6. 加入H2SO4終止反應,50 ml/well。
   7. ELISA Reader 讀取OD490 光密度值,分析和比較病人血清和正常血 清中TFAR19自身抗體的表達水平。
   8. Western blot 分析原發(fā)性腫瘤細胞和正常細胞的TFAR19蛋白的表達水平。

上海慧穎生物科技有限公司 版權(quán)所有    備案號:滬ICP備12016933號-2

技術(shù)支持:化工儀器網(wǎng)    管理登陸    網(wǎng)站地圖

聯(lián)系電話:
15821734033

微信服務號

主站蜘蛛池模板: 在线第一页 | 4hu影院在线观看 | 综合精品在线 | 午夜影院普通用户体验区 | 91美女视频在线 | 钻石午夜影院 | 婷婷在线视频国产综合 | 欧美多人 | 色婷婷亚洲综合 | 日韩高清在线免费观看 | 永久网站色视频在线观看免费 | 毛片你懂的 | 国产悠悠视频在线播放 | 99在线视频精品 | 日本大尺度做爰床视频 | 日本不卡一区二区三区视频 | 日本高清xxxxx | 黄网在线观看免费网站台湾swag | 久久中文字幕网 | 亚洲天天做日日做天天看2018 | 成人免费在线观看视频 | 久久久久久91精品色婷婷 | 中文字幕日韩有码 | 正在播放欧美 | 成人免费观看网站 | 国产成人精品免费视频网页大全 | 国产精品合集一区二区 | 女女综合网 | 日本一级特级毛片视频 | 久久99久久精品免费思思6 | 日本一级在线播放线观看视频 | 久久国产三级 | 国产综合久久久久影院 | 韩日毛片 | 日本性在线 | 天天插天天插 | 手机在线观看亚洲国产精品 | 日韩欧美在线观看视频一区二区 | 97国产超级碰碰在线视频 | 91亚洲精品在看在线观看高清 | 日本伦理网站 |